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    甲基化对限制酶酶切的影响

    DNA甲基转移酶(MTases)普遍存在于原核和真核生物中,它能将S-腺苷甲硫氨酸上的甲基转移到腺嘌呤或胞嘧啶上。当使用限制性内切酶消化DNA时,要考虑DNA是否有甲基化的问题,因为如果识别序列中某个特定碱基被甲基化后,切割就会被完全或者不完全阻断。


    原核生物甲基化

    在原核生物中,DNA甲基转移酶作为限制修饰系统的一个组成部分广泛存在,它们的作用是?;に拗骶槐幌嘤Φ南拗菩阅谇忻盖懈?。大多数实验室使用的大肠杆菌表达三种位点特异性的DNA甲基转移酶。

    1.   Dam甲基转移酶能将甲基转移到GATC序列中的腺嘌呤N6位点上。

    2.   Dcm甲基转移酶能在CCAGG和CCTGG序列内部的胞嘧啶C5位置上甲基化(下图中W=A或T)。

    3.   EcoKI甲基转移酶可将AAC (N6A) GTGC和GCAC (N6A)GTT上的腺嘌呤进行甲基化修饰。


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    如果限制性内切酶的切割对象是从表达Dam或Dcm甲基转移酶的菌株中分离得到的,并且其甲基化识别位点与内切酶识别位点有重叠,那么该限制性内切酶的部分或全部酶切位点有可能被阻断。例如,从dam+ E.coli 中分离的质粒DNA完全不能被识别序列为T/GATCA的BclI所切割。


    E.coli 菌株中的DNA甲基化程度并不完全相同。如pBR322 DNA能被完全甲基化,而λ DNA只有大约50%的Dam位点被甲基化,这是因为在λ DNA被包装到噬菌体头部之前,甲基化酶还没来得及将DNA完全甲基化。因此,被Dam或Dcm甲基化完全阻断的内切酶只能对这些λ DNA进行部分切割。


    质粒DNA上被Dam或Dcm甲基化阻断的限制性位点可以通过克隆方法去除甲基化,即将质粒DNA转化至dam-/dcm-菌株(如 JM110)中进行繁殖。


    如果出现甲基化位点与酶切位点重叠,内切酶酶切也会被阻遏。在这种情况下,Dam或者Dcm序列一部分来自内切酶识别序列,另一部分为识别序列左右旁侧的序列。在设计内切酶酶切时也应该考虑到这种情况。如内切酶XbaI识别序列为T/CTAGA,若其左侧序列为GA或右侧序列为TC,且该DNA是从damE.coli 中分离得到时,XbaI酶切会被阻断。


    真核生物甲基化

    在高等真核生物中发现的CpG甲基转移酶(CpG MTases),能将甲基基团转移至胞

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    嘧啶残基上的C5位点。CpG甲基化形式受 遗传因素的影响,具有组织特异性,并与基因表达相关。在使用限制性内切酶消化真核基因组DNA时尤其要关注CpG甲基化的影响。需要注意的是,一旦DNA被克隆到细菌中后,将不存在CpG甲基化形式。





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